Heidelberg ist als deutsche Großstadt mehrfach an das Straßenverkehrsnetz angebunden. Die A5 verbindet die Stadt mit Frankfurt am Main und dem Norden. Am Autobahnkreuz Heidelberg trifft sich die A5 mit der A656 und der A6, die in Richtung Osten bis nach Stuttgart führt. Auf den vier Ferienstraßen Bergstraße, Bertha Benz Memorial Route, Burgenstraße und Straße der Demokratie gelangt man durch die Naturräume rund um die Stadt wie das Oberrheinische Tiefland und den Odenwald bis in die Fränkische Schweiz oder ins Fichtelgebirge.
Im historischen Stadtgebiet wurde im Jahr 2010 eine Umweltzone eingeführt, die die Stadtteile Handschuhsheim, Neuenheim, Bergheim, Altstadt, Weststadt, Südstadt und Rohrbach enthält. Als Verkehrsader durch das Stadtgebiet führt die B37 am Ufer des Neckars entlang. Heidelberg verfügt über ein Parkleitsystem, das die Autofahrer zu den nächstgelegenen freien Parkplätzen führt. Das Stadtgebiet ist in die Parkzonen Zentrum und Altstadt eingeteilt. Mehrere Hundert Parkplätze stehen am Neuenheimer Feld rund um die Universitätsklinik zur Verfügung.